母乳被公認(rèn)為是嬰兒最理想的食物，最佳的營(yíng)養(yǎng)來(lái)源，母乳已經(jīng)檢測(cè)出至少含有400多種營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，其中的母乳低聚糖（HMOs）是人類母乳中的第三大固體組分，僅次于乳糖(55-70g/L)和脂肪(15-40g/L)， HMOs 是一類包含 200 多種不易消化且非營(yíng)養(yǎng)性的低聚糖混合物，其具有重要的生物學(xué)功能，不僅對(duì)腸道病原微生物起到抗感染的作用，還能維持腸道微生態(tài)的平衡，更有利于嬰兒神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育，并可降低免疫相關(guān)的非傳染性疾病的發(fā)生。目前嬰幼兒配方奶粉主要是用動(dòng)物的乳為原料，特別是牛乳，而牛乳中HMOs的含量非常少，所以在配方奶粉中添加HMOs就非常有必要，這樣可以最大限度地減少配方奶粉喂養(yǎng)和母乳喂養(yǎng)嬰兒之間的發(fā)育差異，從而可能改善配方奶粉喂養(yǎng)嬰兒的整體健康狀況。而隨著國(guó)內(nèi)監(jiān)管機(jī)構(gòu)的公示和批準(zhǔn)， HMOs現(xiàn)已被正式允許用于國(guó)內(nèi)嬰幼兒配方奶粉，含有HMOs的嬰幼兒配方奶粉也陸續(xù)開始上市銷售。
國(guó)家衛(wèi)健委于2023年10月7日發(fā)布公告，正式批準(zhǔn)母乳低聚糖(HMOs)中的2´-FL（2´-巖藻糖基乳糖）和LNnT（乳糖-N-新四糖）可作為食品營(yíng)養(yǎng)強(qiáng)化劑應(yīng)用于嬰幼兒配方奶粉、調(diào)制乳粉(兒童用)，以及特殊醫(yī)學(xué)嬰兒食品[1]。國(guó)家食品安全風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估中心于2024年3月13日發(fā)布，擬征求意見(jiàn)的食品營(yíng)養(yǎng)強(qiáng)化劑新品種中，涉及3´-SL（3´-唾液酸乳糖鈉鹽）和6´-SL（6´-唾液酸乳糖鈉鹽）均屬于HMOs[2]。這些品種原料的檢測(cè)方法均涉及電霧式檢測(cè)器（CAD）。
圖：CAD檢測(cè)器(左：Corona Veo 系列，右：Vanquish CAD系列)
1
乳糖-N-新四糖CAD測(cè)定結(jié)果
1.1依據(jù)公告文件方法，完成系統(tǒng)適應(yīng)性測(cè)試，溶劑連續(xù)進(jìn)樣至少五次，待液相色譜響應(yīng)穩(wěn)定后在電霧式檢測(cè)器條件下進(jìn)行系統(tǒng)適用性測(cè)試。滿足下表?xiàng)l件后可進(jìn)行乳糖-N-新四糖及乳糖-N-新四糖果糖異構(gòu)體含量測(cè)試，測(cè)定結(jié)果均可滿足系統(tǒng)適應(yīng)性要求，結(jié)果見(jiàn)下表所示。
表1. 系統(tǒng)適用性要求及測(cè)試結(jié)果
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1.2校正曲線測(cè)定結(jié)果
乳糖-N-新四糖通過(guò)紫外檢測(cè)器測(cè)定，其線性校正曲線結(jié)果如下圖所示，從結(jié)果可知，乳糖-N-新四糖在160-240µg/mL濃度范圍內(nèi)，強(qiáng)制過(guò)零點(diǎn)，通過(guò)一次線性擬合，結(jié)果良好，相關(guān)系數(shù)R2為0.99941，滿足>0.995要求。
乳糖-N-新四糖果糖異構(gòu)體通過(guò)CAD檢測(cè)器測(cè)定，其線性校正曲線結(jié)果如下圖所示，從結(jié)果可知，乳糖-N-新四糖果糖異構(gòu)體在6-100µg/mL濃度范圍內(nèi)，通過(guò)二次線性擬合，結(jié)果良好，相關(guān)系數(shù)R2為0.99996。
圖 乳糖-N-新四糖校正曲線
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圖 乳糖-N-新四糖果糖異構(gòu)體校準(zhǔn)曲線
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1.3定量限測(cè)定結(jié)果
對(duì)乳糖-N-新四糖果糖異構(gòu)體的定量限進(jìn)行考察，結(jié)果為6.0µg/mL。按標(biāo)準(zhǔn)中樣品濃度0.2 mg/mL計(jì)算，乳糖-N-新四糖果糖異構(gòu)體的檢出濃度可達(dá)0.3%，高于當(dāng)前標(biāo)準(zhǔn)公示1.0%限度要求，完全滿足原料質(zhì)控的需求。
1.4實(shí)際樣品分析測(cè)定結(jié)果
運(yùn)用本文方法，串聯(lián)紫外檢測(cè)器和CAD檢測(cè)器，完全可以滿足對(duì)不同批次營(yíng)養(yǎng)強(qiáng)化劑乳糖-N-新四糖原料中乳糖-N-新四糖(紫外測(cè)定)和乳糖-N-新四糖果糖異構(gòu)體(CAD測(cè)定)的含量同時(shí)測(cè)定的需求，乳糖-N-新四糖果糖異構(gòu)體CAD結(jié)果和乳糖-N-新四糖紫外結(jié)果如下圖所示。
圖 原料中乳糖-N-新四糖果糖異構(gòu)體測(cè)定結(jié)果(CAD)
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圖 原料中乳糖-N-新四糖測(cè)定結(jié)果(UV)
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2
2´-巖藻糖基乳糖原料CAD測(cè)定結(jié)果
依據(jù)公示方法，通過(guò)CAD檢測(cè)器及對(duì)應(yīng)色譜方法，測(cè)定結(jié)果下圖所示，可滿足原料中2´-巖藻糖基乳糖原料中的D-乳糖和二巖藻糖基乳糖含量測(cè)定質(zhì)控的需求。
圖 2’巖藻糖基乳糖樣品色譜圖
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3
3´-唾液酸乳糖鈉鹽&6´-唾液酸乳糖鈉鹽CAD測(cè)定結(jié)果
依據(jù)公示方法，通過(guò)CAD檢測(cè)器及對(duì)應(yīng)色譜方法，結(jié)果如下圖所示，本方法適用于原料中3´-唾液酸乳糖鈉鹽及異構(gòu)體3´-唾液酸乳果糖，6´-唾液酸乳糖鈉鹽和乳糖含量同時(shí)測(cè)定質(zhì)控的需求。
圖 乳糖、3´-唾液酸乳糖鈉鹽&6´-唾液酸乳糖鈉鹽標(biāo)品色譜圖(點(diǎn)擊查看大圖)
Summary
小結(jié)
通過(guò)紫外檢測(cè)器串聯(lián)電霧式檢測(cè)器（CAD）成功復(fù)現(xiàn)了母乳低聚糖中LNnT(乳糖-N-新四糖)當(dāng)前公示的國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)方法。雖然待測(cè)物沒(méi)有明顯的紫外吸收，但對(duì)于原料中含量較高的主成分，公示方法采用紫外檢測(cè)器末端吸收205nm進(jìn)行測(cè)定，效果較為理想；而對(duì)于需要重點(diǎn)控制的主要雜質(zhì)乳糖-N-新四糖果糖異構(gòu)體，由于限度較低，公示標(biāo)準(zhǔn)采用了更加靈敏的CAD檢測(cè)器進(jìn)行分析，方法學(xué)考察結(jié)果顯示，靈敏度和重現(xiàn)性均符合標(biāo)準(zhǔn)要求。
基于CAD檢測(cè)器對(duì)無(wú)/弱紫外吸收物質(zhì)檢測(cè)的優(yōu)勢(shì)，其他類型的母乳低聚糖，如2´-FL（2´-巖藻糖基乳糖）、3´-SL（3´-唾液酸乳糖鈉鹽）及6´-SL（6´-唾液酸乳糖鈉鹽），也同樣適用。同時(shí)，本方法也可用于嬰幼兒配方奶粉、調(diào)制乳粉(兒童用)以及特殊醫(yī)學(xué)嬰兒食品中LNnT含量的測(cè)試，可作為相關(guān)行業(yè)分析人員進(jìn)行該領(lǐng)域分析的重要參考。
參考文獻(xiàn)：
[1] 《關(guān)于桃膠等15種“三新食品”的公告》(2023年第8號(hào))，國(guó)家衛(wèi)生健康委，2023年9月22日.
[2] 關(guān)于公開征求羥基酪醇等7種食品添加劑新品種意見(jiàn)，國(guó)家食品安全風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估中心，2024年3月13日.
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