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測定意義

纖維素酶是由微生物產生的多組分的酶系，能水解纖維素β-1,4葡萄糖苷鍵生成葡萄糖，研究濾紙酶活力對纖維素酶的研究具有非常重要的意義。

測定原理

濾紙酶水解濾紙產生的還原糖能與3,5-二硝基水楊酸生成紅棕色氨基化合物，在540nm處有最大光吸收，在一定范圍內反應液顏色深淺與還原糖的量成正比，可測定計算得濾紙酶的活力。

自備實驗用品及儀器

天平、研缽、低溫離心機、可見分光光度計/酶標儀、微量石英比色皿/96孔板、恒溫水浴鍋。

試劑組成和配制

試劑一：液體25mL×1瓶，4℃保存。

試劑二：液體40mL×1瓶，4℃保存。

濾紙條：50mg×50條。

酶液提取

1. 組織：按照質量（g）：蒸餾水體積(mL)為1：5~10的比例（建議稱取約0.1g，加入1mL蒸餾水）加入蒸餾水，冰浴勻漿后于4℃，12000rpm離心10min，取上清置于冰上待測。

2. 細胞：按照細胞數量（104個）：蒸餾水體積（mL）為500~1000：1的比例（建議500萬細胞加入1mL提取液），冰浴超聲波破碎細胞（功率300w，超聲3秒，間隔7秒，總時間3min）；然后4℃，12000rpm離心10min，取上清置于冰上待測。

3. 培養液或其它液體：直接檢測。

測定操作

1. 根據樣本數量取兩倍數量的濾紙條和Ep管，每支Ep管中放入一個卷狀濾紙條（注意要放入底部），作為底物。

2. 對照管：取200μL滅活的酶液，加入500μL試劑一，充分混勻，再加入放有濾紙條的Ep管中，標注為對照管。

3. 測定管：取200μL酶液，加入500μL試劑一，充分混勻，再加入放有濾紙條的Ep管中，標注為測定管。

4. 對照管和測定管同時置于50℃水浴鍋中反應30min。

5. 加入800μL試劑二，沸水浴5min，自來水冷卻后取200μL于微量石英比色皿/96孔板中測定540nm處吸光值，分別記為A對照管和A測定管，△A= A測定管- A對照管。

酶活性計算公式

1. 用微量石英比色皿測定的計算公式如下

標準曲線：y = 0.2805x - 0.0255，R2 = 0.9991 

（1）按照蛋白濃度計算

酶活性定義：在50℃，pH4.6條件下，每毫克蛋白每分鐘分解濾紙產生1mg葡萄糖所需的酶量為一個酶活力單位。

FPA（U/mg prot）=（△A+0.0255）÷ 0.2805×V反總÷（V樣×Cpr）÷T

                = 0.891×（△A+0.0255）÷ Cpr

（2）按照樣本質量計算

酶活性定義：在50℃，pH4.6條件下，每克組織每分鐘分解濾紙產生1mg葡萄糖所需的酶量為一個酶活力單位。

FPA（U/g）=（△A+0.0255）÷ 0.2805×V反總÷（W×V樣÷V樣總）÷T

             = 0.891×（△A+0.0255）÷ W

（3）按液體體積計算

酶活性定義：在50℃，pH4.6條件下，每毫升培養液每分鐘分解濾紙產生1mg葡萄糖所需的酶量為一個酶活力單位。

FPA（U/mL）=（△A+0.0255）÷ 0.2805×V反總÷V樣÷T

            = 0.891×（△A+0.0255）

（4）按細胞數量計算

酶活性定義：在50℃，pH4.6條件下，每104個細胞每分鐘分解濾紙產生1mg葡萄糖所需的酶量為一個酶活力單位。

FPA（U/104cell）=（△A+0.0255）÷ 0.2805×V反總÷（V樣×細胞數量（萬個）÷V樣總）÷T

               = 0.891×（△A+0.0255）÷ 細胞數量（萬個）

V反總：反應總體積，1.5mL，V樣：反應體系中加入樣本體積，0.2mL；V樣總：加入提取液體積，1mL；Cpr：樣本蛋白濃度，mg/mL；W：樣本質量，g；T：反應時間，30min

2. 用96孔板測定的計算公式如下

標準曲線：y = 0.1403x - 0.0255，R2 = 0.9991 

（1）按照蛋白濃度計算

酶活性定義：在50℃，pH4.6條件下，每毫克蛋白每分鐘分解濾紙產生1mg葡萄糖所需的酶量為一個酶活力單位。

FPA（U/mg prot）=（△A+0.0255）÷ 0.1403×V反總÷（V樣×Cpr）÷T

                =1.782×（△A+0.0255）÷ Cpr

（2）按照樣本質量計算

酶活性定義：在50℃，pH4.6條件下，每克組織每分鐘分解濾紙產生1mg葡萄糖所需的酶量為一個酶活力單位。

FPA（U/g）=（△A+0.0255）÷ 0.1403×V反總÷（W×V樣÷V樣總）÷T

          = 1.782×（△A+0.0255）÷ W

（3）按液體體積計算

酶活性定義：在50℃，pH4.6條件下，每毫升培養液每分鐘分解濾紙產生1mg葡萄糖所需的酶量為一個酶活力單位。

FPA（U/mL）=（△A+0.0255）÷ 0.1403×V反總÷V樣÷T

            = 1.782×（△A+0.0255）

（4）按細胞數量計算

酶活性定義：在50℃，pH4.6條件下，每104個細胞每分鐘分解濾紙產生1mg葡萄糖所需的酶量為一個酶活力單位。

FPA（U/104cell）=（△A+0.0255）÷ 0.1403×V反總÷（V樣×細胞數量（萬個）÷V樣總）÷T

               = 1.782×（△A+0.0255）÷ 細胞數量（萬個）

V反總：反應總體積，1.5mL，V樣：反應體系中加入樣本體積，0.2mL；V樣總：加入提取液體積，1mL；Cpr：樣本蛋白濃度，mg/mL；W：樣本質量，g；T：反應時間，30min

注意事項

1. 用干凈的鑷子取出濾紙條，帶手套卷成卷放入Ep管底部。

2. 樣本滅活時保證同一批樣本處理時間一致，建議沸水浴十分鐘。

3. 批量樣本測定之前先做1-2個樣本的預實驗，若吸光值超過1.2，建議將樣本用蒸餾水稀釋后再進行測定，計算公式中乘以稀釋倍數。

4. 顯色后取檢測液時注意槍頭不要碰到濾紙條，以免帶入毛狀物，影響測定結果。

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